摘要：《Cardiovascular Research》刊發(fā)的文章中，研究人員使用低壓加速基因槍GDS-80，按照制造商的方案將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到VSMC中。將2mg質(zhì)粒DNA懸浮于5ml PBS中，并在15psi的氦氣壓力下輸送至培養(yǎng)的血管平滑肌細(xì)胞。該方法的轉(zhuǎn)染效率為30%。結(jié)果表明GADD153在牽張誘導(dǎo)的VSMC凋亡中起作用。

　　GADD153(生長停滯和DNA損傷誘導(dǎo)基因153)是一種凋亡調(diào)節(jié)基因，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)應(yīng)激期間表達(dá)增加。機(jī)械拉伸如何影響血管平滑肌細(xì)胞凋亡過程中GADD153的調(diào)節(jié)尚不完全清楚。

　　在《Cardiovascular Research》中的一篇報道中，研究人員通過使用低壓手持式基因槍向血管平滑肌細(xì)胞中投遞大鼠GADD153啟動子構(gòu)建體，驗證了機(jī)械牽張誘導(dǎo)凋亡的血管平滑肌細(xì)胞中GADD153表達(dá)的假說。

　　研究人員將生長在柔性膜上的大鼠血管平滑肌細(xì)胞以60周/分鐘的速度真空拉伸至最大延伸率的20%。采用成年大鼠主動脈-腔靜脈分流模型研究GADD153的表達(dá)。拉伸18小時后，周期性拉伸顯著增加GADD153蛋白和mRNA的表達(dá)。拉伸前30min加入c-jun N末端激酶(JNK)抑制劑SP600125、JNK siRNA、腫瘤壞死因子-a(TNF-a)和TNF-α受體抗體可抑制GADD153蛋白的誘導(dǎo)。

　　一個-845到+85 bp的大鼠GADD153啟動子構(gòu)建體如下。用正向引物ctcgaggaaggca-taagagccatca和反向引物ccgcttctcctcagggttccggctgt擴(kuò)增大鼠基因組DNA。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)M1uI和Bg1II限制性內(nèi)切酶酶切后連接到用相同酶切的pGL3堿性熒光素酶質(zhì)粒載體中。GADD153啟動子包含AP-1保守位點(TGACTCA)，位于–246到–240 bp。對于突變體，使用突變試劑盒突變AP-1結(jié)合位點。DNA測序證實了位點特異性突變。使用低壓加速基因槍GDS-80，按照制造商的方案將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到VSMC中。將2mg質(zhì)粒DNA懸浮于5ml PBS中，并在15psi的氦氣壓力下輸送至培養(yǎng)的血管平滑肌細(xì)胞。該方法的轉(zhuǎn)染效率為30%。

　　凝膠位移實驗表明，牽張后激活因子1(AP-1)的DNA結(jié)合活性增強(qiáng)。SP600125、JNK-siRNA和TNF-a抗體可消除牽張誘導(dǎo)的結(jié)合活性。拉伸增加，而GADD153 Mut質(zhì)粒、SP600125和c-jun抗體消除了啟動子活性。牽張血管平滑肌細(xì)胞的條件培養(yǎng)液和外源性給予非牽張血管平滑肌細(xì)胞TNF-α重組蛋白均可增加GADD153蛋白的表達(dá)，與牽張后相似。成年大鼠主動脈-腔靜脈分流術(shù)的體內(nèi)模型也顯示主動脈中GADD153蛋白表達(dá)增加。

　　周期性牽張增強(qiáng)培養(yǎng)大鼠血管平滑肌細(xì)胞GADD153的表達(dá)。牽張誘導(dǎo)的GADD153由TNF-α介導(dǎo)，至少部分通過JNK和AP-1途徑介導(dǎo)。這些結(jié)果表明GADD153在牽張誘導(dǎo)的VSMC凋亡中起作用。

　　[1] The molecular regulation of GADD153 in apoptosis of cultured vascular smooth muscle cells by cyclic mechanical stretch[J]. Cardiovascular Research, 2008(3):551-9.